转基因造血细胞体内长期扩增调控与转基因血液恶性肿瘤体外细胞培养模型的建立

【摘要】研究背景：众所周知,许多细胞的关键功能,比如细胞分裂分化成为特定细胞、对刺激因子的应答,甚至细胞死亡,都是通过细胞信号转导和基因活化来完成的。多年来的研究证实“二聚化”是细胞内外蛋白活化中信号转导通路的核心,是细胞分子生物学中的一般机理。当两个蛋白发生二聚化,信号转导就被激活。根据这些分子生物学机制,研发了基因调控表达技术,通过利用小分子化合物来控制细胞的生长,使细胞的特定信号激活或转录成为可能。最近研究已经证实,JAKs-STATs信号转导通路在干细胞的自我更新中扮演着重要的作用,而且大多数细胞因子又是通过JAKs-STATs来传递信号的。JAK2是JAK家族的重要成员,在干／祖细胞的自我更新中又起着重要的枢纽性作用。因此,我们构建克隆了一个以MSCV-Based的逆转录病毒载体,内含有JAK2的功能信号区域和两个对二聚化化学诱导物(AP20187)有高度亲和力的结合位点(F36v)所组成。AP20187是依据药物分子结构和蛋白质工程学设计而开发的小分子靶向基因合成药物。我们先前已经证实该药联合干细胞因子KL(c-kitligand)和或FL(Flt-3ligand)可以激活JAK2信号转导通路使JAK2转导的多潜能造血干／祖细胞明显扩增。这项技术的应用,克服了干细胞基因治疗中基因转移率低下和基因不能有效转导入少数干细胞的制约,而且基因调控表达技术的应用能够使干／祖细胞定向分化为我们所需要的细胞和组织类型。目的：探讨JAK2转基因骨髓造血细胞体内长期扩增调控和定向分化潜能的可行性和安全性。方法：我们构建克隆了一个MSCV-based逆转录病毒载体称作MGI-2F36vJAK2(GFP-F36vJAK2),它编码一个绿色荧光蛋白(GFP)和两个改进的FK506结合蛋白(F36v)与酪氨酸激酶JAK2组成的融合蛋白,F36v是二聚化化学诱导物合物AP20187的高度亲和力结合位点。应用该载体转染GPE+86包装细胞株,获得高效价病毒转染的BaF3细胞株测定MTT试验,用RT-PCR测定Ba/F3细胞株的JAK2mRNA表达水平。将Ly5.1小鼠的骨髓细胞与照射过的GPE+86产毒细胞株共培养48h实现基因转导,将转导后的造血细胞通过尾静脉注射入10只雌性受者C57BL/6小鼠体内。7只为实验组,3只为对照组,移植17周后,实验组小鼠分别接受三个疗程的AP20187(10ng/kg/day)腹腔内注射,第一个疗程为28天,后两个疗程各为7天。而对照组小鼠同期内只接受不含AP20187的PBS腹腔内注射。实验中,定期检测全血细胞计数、流式细胞仪动态测定外周血各系GFP阳性细胞的表达率。另外,选取10只JAK2移植小鼠进行AP20187联合FL的分组实验研究,FL注射剂量为5μg/mouse/day。在JAK2与MPL体内竞争性研究中,分别选取GFP-F36vJAK2基因转染的Ly5.1小鼠骨髓细胞和等量的dsRed-F36vMPL转染的Ly5.1小鼠骨髓细胞混合后共同移植入10只受者C57BL/6(Ly5.2)小鼠体内,进行JAK2和MPL的体内竞争性研究和观察。结果：1.MTT试验显示：转GFP-F36vJAK2基因的Ba/F3细胞株在没有IL-3条件下,AP20187可以支持和促使其生长。实时定量PCR(RT-PCR)测定转染JAK2的和非转染的Ba/F3细胞株JAK2mRNA的表达量,结果显示：转染的细胞株JAK2mRNA表达量是非转染细胞株内源性JAK2mRNA的25倍多。2.a)第一个疗程AP20187注射后,实验组所有小鼠于疗程结束4至5周后,GFP阳性的红细胞百分数从基线水平22-38%上升到峰值水平84～92%；而停用AP20187于11至15周后,GFP阳性红细胞百分比逐渐降低至低点水平3-28%。b)6只小鼠接受了第二个疗程的AP20187腹腔内注射(7天),注射后的小鼠GFP阳性红细胞百分比由基线水平4-28%升至峰值36～65%。c)3只小鼠接受了AP20187注射(7天),同样GFP阳性红细胞百分数从基线水平4-25%升至峰值水平25～53%。3.所有小鼠的GFP阳性红细胞百分比随AP20187应用或停药而上升或下降；对照组小鼠,移植后34～41周,没有观察到GFP阳性红细胞百分比的自发性升高。4.实验组所有小鼠,在给予AP20187注射后,GFP阳性的血小板、GFP阳性的中性粒细胞或T细胞均没有观察到相应的升高或下降等动态变化。5.应用AP20187的实验组小鼠脾脏重量相比于对照组明显增加(p值为0.05)。6.AP20187联合FL应用,结果显示：JAK2在扩增红细胞的同时,也可以使其它系的细胞扩增特别是粒细胞。7.JAK2与MPL体内竞争性实验证实：JAK2不能扩增血小板,而且JAK2扩增红细胞的能力相对弱于MPL8.试验中所有死去的小鼠均与AP20187注射无关。结论：1、该研究证实了AP20187诱导的JAK2二聚化,激活细胞信号转导通路,可以使小鼠体内基因修饰的红细胞得以扩增,该扩增仅限于红系细胞,不影响包括粒系、淋巴系、血小板在内的其它系细胞生长。2、此研究实现了小鼠体内红系细胞的扩增,该技术赋予了基因修饰的红系细胞较未修饰的其它细胞一种优先生长和或生存的优势。3、该研究符合基因治疗应用的必要标准：即细胞的生长仅限于基因修饰的细胞群,并且生长是可逆的。JAK2信号的活化完全依赖于小分子二聚化化学诱导物(AP20187)的应用。4、该技术为有条件地扩增体内基因修饰的细胞群提供了一个很好的研究平台,将来可以广泛应用于细胞和基因治疗。特别一提的是,该研究结果显示,所扩增的细胞仅限于红系细胞,不影响其它细胞系,尤其适合应用于镰状细胞性贫血和p-地中海贫血的基因治疗。背景与目的：大多数血液恶性肿瘤存在染色体异位,异位染色体产生新的融合基因,并编码融合蛋白。目前在血液疾病领域已发现超过200种染色体改变和50种分子异常,这些异常改变已成为不同白血病的分子特定标记,用这些标记可以诊断不同类型白血病。大量的证据表明,除肿瘤融合基因外,联合不同调控因子,可以产生不同类型白血病。我们评价了一系列白血病相关融合基因,旨在探讨用这些融合基因建立血液恶性肿瘤体外细胞培养模型并对其生物学特性进行研究。方法：我们构建了几种带有GFP(绿色荧光蛋白)表达、能够编码不同白血病／淋巴瘤相关融合蛋白的逆转录病毒载体(如：TEL-PDGFR,Rabaptin5-PDGFR,p210BCR-ABL,AML1-ETO,NPM-ALK)。将病毒载体导入小鼠的原代骨髓细胞中。转染的骨髓细胞随后培养在含有10%FCS的IMDM培养基中。将细胞分为：无生长因子组和含有不同生长因子的各种组合组：1)c-kit配体联合flt3配体组(KL+FL);2)IL-3+TPO+G-CSF+Hyper-IL-6(3/T/G/H6)组；3)KL+FL+3/T/G/H6组。检测肿瘤融合蛋白联合各种生长因子支持骨髓转染细胞的自我更新、扩增生长的能力。并对肿瘤基因转染扩增后的细胞进行流式细胞仪、RT-PCR、Westernblotting、Southernblotting进一步检测。结果：研究结果提示转染的细胞能够持续、对数级的生长扩增。KL联合FL能够支持转染编码TEL-PDGFR,Rabaptin5-PDGFR、AML1-ETO、NPM-ALK病毒载体的骨髓细胞自我更新、生长扩增；而转染p210BCR-ABL病毒载体的骨髓细胞除需要KL和FL外,还需要IL-3的参与。扩增培养的细胞形态与所对应的肿瘤基因相关的血液肿瘤表现相一致。对扩增培养的细胞与所对应的肿瘤基因经流式细胞仪、RT-PCR、Westernblotting、Southernblotting进一步证实。结论：本研究建立了一套体外模型培养体系,该体系提供了一种研究血液恶性肿瘤及其细胞信号转导的方法,今后可用于筛选治疗恶性血液肿瘤的药物。
【作者】赵声明；
【导师】王建祥；
【作者基本信息】北京协和医学院，内科学，2014，博士
【关键词】JAK2；转基因；造血细胞；体内；扩增；血液恶性肿瘤；细胞培养；模型；体外；

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